Родители не одобряли увлечения сына, и по их настоянию в 1881 г. Леонид стал студентом медицинского факультета Московского университета. Через два года он перевелся в Новороссийский университет (Одесса), где до 1885 г. изучал юриспруденцию.
Одновременно Пастернак продолжал заниматься живописью: в 1882 г. учился в московской школе-студии Е.С.Сорокина, в 1883–1886 гг. — в мюнхенской Академии художеств у И.К.Гертериха и А.Лицен-Мейера. Брал уроки офорта у И.И.Шишкина.
Участие в ежегодных выставках Товарищества передвижников принесло молодому художнику первый серьезный успех: в 1889 г. его картина «Письмо с родины» была приобретена П.М.Третьяковым. Окрыленный успехом, Пастернак переезжает в Москву. Он женится на пианистке Розалии Исидоровне Кауфман (1868–1939); в 1890 г. у них рождается первенец Борис — будущий русский поэт.
Вскоре художник предпринимает поездку в Париж. По возвращении Пастернака оттуда его произведения становятся более изысканными и динамичными, он начинает использовать новую технику — сочетание темперы, пастели и угля.
В основе творческого метода Пастернака лежат быстрые, почти мгновенные зарисовки, которые сам он называет школой «настоящего импрессионизма». Ощущение фиксации впечатления художнику удается сохранить и в живописных произведениях — за счет выбора будто бы случайного движения, раскрывающего образ. Работы Пастернака отличает своеобразная, основанная на контрастах света и тени, передача световоздушной среды.
Пастернак проявил себя как замечательный художник книги: им созданы рисунки к собранию сочинений М.Ю.Лермонтова (1891), четыре акварели к роману «Война и мир» (1893). По приглашению Л.Н.Толстого в 1898–1899 гг. он выполнил иллюстрации к роману «Воскресение», остающиеся непревзойденными до сих пор.
Л.О.Пастернак был членом объединения «Мир искусства» и одним из учредителей Союза русских художников. С 1894 по 1921 г. он преподавал в Московском училище живописи, ваяния и зодчества (впоследствии — ВХУТЕМАС), а в 1905 г. получил звание академика живописи.
Талантливый портретист, Пастернак проникновенно передает внутреннюю жизнь своих моделей. Наиболее известны его групповые композиции: «Л.Н.Толстой с семьей в Ясной Поляне» (Государственный музей Л.Н.Толстого), «Заседание совета преподавателей Московского училища живописи, ваяния и зодчества» (обе — 1902, Русский музей), «Поздравление» (портрет детей художника; 1914, Третьяковская галерея).
В 1921 г. Пастернак выезжает на лечение в Германию. С женой и дочерьми он поселяется в Берлине, где создает портреты выдающихся современников:
А.М.Ремизова (1924), А.Эйнштейна (1924, Иерусалимский университет), Р.М.Рильке (1926), Г.Гауптмана (1930) и др. В 1927 и 1932 гг. в Берлине проходят две персональные выставки мастера. В период эмиграции его интерес привлекает еврейская тематика: он участвует в историко-этнографической экспедиции в Палестину, издает монографию «Рембрандт и еврейство в его творчестве», пишет цикл портретов выдающихся деятелей еврейской культуры. В 1932 г. в Берлине была издана книга его воспоминаний о Л.Н.Толстом, но большая часть тиража погибла при публичном сожжении книг нацистами.
Покинув Германию в 1938 г., Леонид Осипович перебрался в Англию, где тогда проживали его младшая дочь. Некоторое время работал в Лондоне, в последние годы жил в Оксфорде, в доме дочери Лидии.
Умер Л.О.Пастернак в Оксфорде 31 мая 1945 г.

Большинство подлинников, а также множество авторских повторений, эскизов и вариантов иллюстраций Л.О.Па­стернака к «Воскресению» хранится в Государственном музее Л.Н.Толстого в Москве. Ряд черновых набросков находится в собрании Музея-усадьбы Л.Н.Толстого «Ясная Поляна».
Первоначально эти иллюстрации были опубликованы в журнале «Нива» за 1899 г. (№11–52), где ро­ман впервые стал печататься. Их количество было пополнено в отдельном издании «Воскресения», выпущенном А.Ф.Марксом в 1900 г. непосредственно вслед за напечатанием ро­мана в «Ниве». По цензурным требованиям две иллюстрации — зарисовка политических на полуэтапе и эпизод раздачи англичанином Евангелий — в издании Маркса отсутствуют. Две эти иллюстрации воссоединились с остальными в том же году в одном из английских изданий «Воскресения» в издательстве «Сво­бодное слово». Все 33 иллюстрации были также выпущены «Свободным словом» в 1901 г. в виде папки.
Все эти издания включали в себя только черно-белые иллюстрации, оригиналы которых представляют собой рисунки на бумаге или картоне, выполненные итальянским карандашом с использованием белил (в двух случаях — живопись маслом на картоне).
В 1915 г. в издательстве И.Д.Сытина вышло отдельное роскошное издание романа, в котором, помимо 24 черно-белых иллюстраций (включая впервые публикуемый лист «По дороге из суда в тюрьму»), были помещены 10 авторских вариантов, выполненных в цвете.
При жизни художника иллюстрации печатались в отдельных изданиях еще дважды: в берлинском издательстве «Нева» в 1923 г. и в издательстве «Academia» (Москва; Ленинград) в 1935 г.
В последнее из указанных изданий вошли 35 иллюстраций (включая — впервые — вариант иллюстрации «Весна» с силуэтом Л.Н.Толстого), воспроизведенные в основном по оригиналам из Государственного Толстовского музея (однако только четыре из них были напечатаны по цветным оригиналам). Редактор этого издания обратил внимание читателя на то, что две иллюстрации Пастернака не соответствуют толстовскому тексту. Эти несоответствия возникли либо в силу обычной корректорской небрежности при печатании «Воскресения» в «Ниве», либо в связи с исправлениями редактора журнала Р.И.Сементковского:
«Так, иллюстрация к XIV главе первой части изображает две фигуры (кроме ямщика), едущих в санях к тетушкам Нехлюдова в страстную субботу, — священника и дьякона — в связи со следующим текстом „Нивы“: „Вечером в субботу, накануне Светлого Христова Воскресения, священник с дьяконом... приехали служить заутреню“. В подлинном же толстовском тексте (и в издании „Свободного слова“) говорится, что к тетушкам приехали „священник с дьяконом и дьячком“, то есть в санях, кроме ямщика, должны были находиться три фигуры. Иллюстрация к XXIV главе той же части изображает стоящую фигуру Масловой, кото­рую трогает за рукав халата жандарм. Это соответствует следующему тексту „Нивы“: „Когда Картинкин и Бочкова вышли, она все еще стояла на месте и плакала, так что жандарм должен был тронуть ее за рукав ха­лата“. Но в подлинном толстовском тексте (и в издании „Свободного слова“) вместо „стояла“ читается „сидела“».